服务内容

1  化妆品中2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料检验-范围

本方法规定了高效液相色谱法测定化妆品中2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料的含量。

本方法适用于染发类化妆品中2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料含量测定。

化妆品中的原料成分以多种形式存在，如硫酸盐、盐酸盐等，当多种形式同时存在时，应以其中的一种形式表示。

本方法所指的15种原料包括2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐、羟苯并吗啉、2，6-二羟乙基氨甲苯、3-硝基对羟乙氨基酚、2-甲基-5-羟乙氨基苯酚、羟乙基-3，4-亚甲二氧基苯胺盐酸盐、4-羟丙氨基-3-硝基苯酚、HC黄4号、5-氨基-6-氯邻甲酚、HC黄2号、5-氨基-4-氯邻甲酚、羟乙基-2-硝基对甲苯胺、分散紫1号、HC橙1号和HC红1号。

《化妆品安全技术规范》（2015年版）7.2 化妆品中对苯二胺等32种组分检验方法中部分原料对本方法存在干扰，如样品中同时含有相互干扰的成分，需调整流动相比例排除干扰或通过质谱确证方法确证。5.3项参考色谱条件1下的干扰情况如下：2-氯对苯二胺硫酸盐、邻氨基苯酚和2-甲基间苯二酚对2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐有干扰；2-硝基对苯二胺对羟苯并吗啉有干扰；N,N-二乙基对苯二胺硫酸盐对2,6-二羟乙基氨甲苯有干扰；甲苯-3,4-二胺对3-硝基对羟乙氨基酚有干扰；6-氨基间甲酚和N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺盐酸盐对2-甲基-5-羟乙氨基苯酚有干扰；苯基甲基吡唑啉酮对4-羟丙氨基-3-硝基苯酚有干扰；1,5-萘二酚对5-氨基-6-氯邻甲酚有干扰；32种原料和15种原料在5.3项参考液相色谱条件1下的分离图谱见附录A。

2  化妆品中2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料检验-方法提要

样品提取后，经高效液相色谱仪分离，二极管阵列检测器检测，根据保留时间和紫外光谱定性，峰面积定量，以标准曲线计算含量。

本方法对2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料的检出限、定量下限及取样量为0.5 g时的检出浓度及最低定量浓度见表1。

表1 15种原料的检出限、定量下限、检出浓度和最低定量浓度

 

序号	原料名称	检出限 （µg）	定量下限（µg）	检出浓度（µg/g）	最低定量浓度（µg/g）
1	2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐	7.5×10-3	2.0×10-2	30	80
2	羟苯并吗啉	7.0×10-3	2.0×10-2	28	80
3	2，6-二羟乙基氨甲苯	2.5×10-3	7.0×10-3	10	28
4	3-硝基对羟乙氨基酚	4.0×10-3	1.0×10-2	16	40
5	2-甲基-5-羟乙氨基苯酚	7.0×10-3	2.0×10-2	28	80
6	羟乙基-3，4-亚甲二氧基苯胺盐酸盐	2.0×10-2	5.0×10-2	80	200
7	4-羟丙氨基-3-硝基苯酚	5.0×10-3	1.3×10-2	20	52
8	HC黄4号	1.0×10-2	2.5×10-2	40	100
9	5-氨基-6-氯邻甲酚	8.0×10-3	2.0×10-2	32	80
10	HC黄2号	3.0×10-3	1.0×10-2	12	40
11	5-氨基-4-氯邻甲酚	5.0×10-3	1.5×10-2	20	60
12	羟乙基-2-硝基对甲苯胺	2.5×10-3	7.5×10-3	10	30
13	分散紫1号	4.0×10-3	1.0×10-2	16	40
14	HC橙1号	5.0×10-3	1.5×10-2	20	60
15	HC红1号	7.0×10-3	2.0×10-2	28	80

3  化妆品中2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料检验-试剂和材料

除另有规定外本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为 GB/T 6682规定的一级水。

3.1  无水乙醇。

3.2  乙腈，色谱纯。

3.3  亚硫酸氢钠。

3.4  乙酸铵。

3.5  0.02 mol/L乙酸铵溶液：称取1.54 g乙酸铵（3.4），加水至1000 mL，经0.45 µm滤膜过滤。

3.6  标准物质：参考附录B。

3.7  标准储备溶液

称取各原料对照品0.1 g（精确到0.0001 g），分别置10 mL容量瓶中，以2 g/L亚硫酸氢钠水溶液和无水乙醇（3.1）（1+1）的混合溶液溶解并定容至10 mL，制成浓度约为10 g/L的各原料标准储备溶液。以下原料在上述溶剂中的溶解性较差，可分别采取如下措施：2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐直接用2 g/L亚硫酸氢钠水溶液溶解并定容；分散紫1号、HC黄4号、HC黄2号和HC红1号需将称样量减少至20 mg（精确到0.01 mg），再用无水乙醇（3.1）溶解定容，配成浓度约为2 g/L的各原料标准储备溶液。储备溶液保存于0 ℃～4 ℃冰箱中，应于48小时内使用。

4  化妆品中2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料检验-仪器和设备

4.1  高效液相色谱仪，二极管阵列检测器。

4.2  天平。

4.3  超声波清洗器。

4.4  离心机。

4.5  涡旋振荡器。

5  化妆品中2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料检验-分析步骤

5.1  混合标准系列溶液的制备

分别取适量标准储备溶液（3.7），用无水乙醇（3.1）+水（1+1）稀释定容，配制成浓度为 5 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L 的混合标准系列溶液。临用现配。

注：实验室可根据实际情况调整合适的标准系列溶液浓度范围。

5.2  样品处理

称取样品 0.5 g（精确到 0.001g）于 10 mL 具塞比色管中，加无水乙醇（3.1）+水（6+4）的混合溶液至10 mL刻度，涡旋混匀，冰浴超声15 min。离心，取上清液经0.45 µm微孔滤膜过滤，滤液作为待测溶液，并尽快测定。根据实际样品的检测情况可对称样量或定容体积进行调整。

5.3  参考色谱条件1

色谱柱：C18 柱（4.6 mm×250mm，5μm），或等效色谱柱；

流动相：流动相A：乙腈（3.2）；流动相B：0.02 mol/L乙酸铵溶液（3.5）；

梯度洗脱程序：

 

时间（min）	流动相A（%）	流动相B（%）
0	10	90
15	25	75
25	55	45
30	62	38
31	10	90
40	10	90

流速：1.0 mL/min；

检测波长：HC黄4号、HC黄2号、HC橙1号为425 nm；分散紫1号、HC红1号为520 nm；其它原料在230 nm检测；

柱温：30 ℃；

进样体积：5 µL。

5.4  参考色谱条件2

色谱柱： C18 柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），或等效色谱柱；

流动相：流动相A：乙腈（3.2）；流动相B：0.02 mol/L乙酸铵溶液（3.5）；

梯度洗脱程序：

 

时间（min）	流动相A（%）	流动相B（%）
0	10	90
8	25	75
13	90	10
15	10	90
20	10	90

流速：0.2 mL/min；

检测波长：同参考色谱条件1；

柱温：30 ℃；

进样体积：2 µL。

5.5  测定

在“5.3”或“5.4”色谱条件下，取混合标准系列溶液（5.1）分别进样，进行色谱分析，以标准系列溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

取“5.2”项下的待测溶液进样，根据保留时间和紫外光谱图定性，测得峰面积，根据标准曲线得到待测溶液中各原料的浓度。按“6”计算样品中各原料的含量。

6  化妆品中2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料检验-分析结果的表述

6.1  计算

                             D×ρ×V

                         ω = ———— ×100

                              m×106

式中：ω—— 化妆品中2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料的质量分数，%；

         ρ—— 从标准曲线上得到待测原料的质量浓度，mg/L；

         V—— 样品定容体积，mL；

         m—— 样品取样量，g；

         D—— 稀释倍数（不稀释则取1）。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

6.2  回收率和精密度

15种染发剂原料的提取回收率在85%-115%之间，方法回收率在85%-114%之间，相对标准偏差在0.7%-9.7%之间(n=6)。

7  化妆品中2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料检验-图谱

图1混合标准溶液在230 nm下的色谱图（参考色谱条件1）

1：2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐（10.178 min）；2：羟苯并吗啉（11.321 min）；3：2，6-二羟乙基氨甲苯（12.655 min）；4：3-硝基对羟乙氨基酚（14.342 min）；5：2-甲基-5-羟乙氨基苯酚（15.263 min）；6：羟乙基-3，4-亚甲二氧基苯胺盐酸盐（16.694 min）；7：4-羟丙氨基-3-硝基苯酚（17.341 min）；8：HC黄4号（19.470 min）；9：5-氨基-6-氯邻甲酚（20.597 min）；10：HC黄2号（22.889 min）；11：5-氨基-4-氯邻甲酚（23.957 min）；12：羟乙基-2-硝基对甲苯胺（25.782 min）；13：分散紫1号（26.893 min）；14：HC橙1号（29.819 min）；15：HC红1号（30.378 min）

图2混合标准溶液在425 nm下的色谱图（参考色谱条件1）

8：HC黄4号（19.470 min）；10：HC黄2号（22.890 min）；14：HC橙1号（29.820 min）

图3 混合标准溶液在520 nm下的色谱图（参考色谱条件1）

13：分散紫1号（26.894 min）；15：HC红1号（30.380 min）

图4混合标准溶液在230 nm下的色谱图（参考色谱条件2）

1：2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐（3.850 min）；2：羟苯并吗啉（4.321 min）；3：2，6-二羟乙基氨甲苯（5.303 min）；4：3-硝基对羟乙氨基酚（6.043 min）；5：2-甲基-5-羟乙氨基苯酚（6.557 min）；6：羟乙基-3，4-亚甲二氧基苯胺盐酸盐（7.077 min）；7：4-羟丙氨基-3-硝基苯酚（7.752 min）；8：5-氨基-6-氯邻甲酚（8.682 min）；9：HC黄4号（9.207 min）；10：HC黄2号（11.190 min）；                           11：5-氨基-4-氯邻甲酚（11.697 min）；12：羟乙基-2-硝基对甲苯胺（12.378 min）； 13：分散紫1号（12.747 min）；14：HC橙1号（13.482  min）；15：HC红1号（13.605 min）

 

图5混合标准溶液在425 nm下的色谱图（参考色谱条件2）

9：HC黄4号（9.207 min）；10：HC黄2号（11.190 min）；14：HC橙1号（13.482 min）

图6混合标准溶液在520 nm下的色谱图（参考色谱条件2）

13：分散紫1号（12.747 min）；15：HC红1号（13.605 min）

附录A

液相色谱条件1下32种原料和15种原料的分离和干扰情况

32种原料和15种原料在5.3项参考色谱条件1下的分离图谱和出峰时间如图A所示。干扰情况如下：2-氯对苯二胺硫酸盐、邻氨基苯酚和2-甲基间苯二酚对2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐、2-硝基对苯二胺对羟苯并吗啉、N,N-二乙基对苯二胺硫酸盐对2,6-二羟乙基氨甲苯、甲苯-3,4-二胺对3-硝基对羟乙氨基酚、6-氨基间甲酚和N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺盐酸盐对2-甲基-5-羟乙氨基苯酚、苯基甲基吡唑啉酮对4-羟丙氨基-3-硝基苯酚和1,5-萘二酚对5-氨基-6-氯邻甲酚有干扰。

以下32种原料和15种原料的分离和出峰时间仅供参考，实际干扰情况可能会因为仪器、色谱柱等检测条件的不同而有所变化。

图A 32种和15种染发剂原料在参考色谱条件1下的分离色谱图

32种原料：1：对苯二胺（3.980 min）；2：对氨基苯酚（4.560 min）；3：甲苯-2,5-二胺硫酸盐（5.377 min）；4：间氨基苯酚（6.603 min）；5：邻苯二胺（8.183 min）； 6：2-氯对苯二胺硫酸盐（8.980 min）； 7：邻氨基苯酚（8.913 min）；8：间苯二酚（8.153 min）；9：2-硝基对苯二胺（9.963 min）；10：甲苯-3,4-二胺（13.137 min）；11：4-氨基-2-羟基甲苯（12.130 min）；12：2-甲基间苯二酚（9.377 min）；13：6-氨基间甲酚（14.07 0min）；14：苯基甲基吡唑啉酮（16.027 min）；15：N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺盐酸盐（14.207 min）；16：4-氨基-3-硝基苯酚（12.870 min）；17：间苯二胺（5.557 min）；18：2,4-二氨基苯氧基乙醇双盐酸盐（4.837 min）；19：氢醌（5.533 min）；20：4-氨基间甲酚（6.493 min）；21：2-氨基-3-羟基吡啶（3.933 min）；22：N,N-双(2-羟乙基)对苯二胺硫酸盐（5.893 min）；23：对甲基氨基苯酚硫酸盐（8.433min）；24：4-硝基邻苯二胺（13.533 min）；25：2,6-二氨基吡啶（5.060 min）；26：N,N-二乙基对苯二胺硫酸盐（11.737 min）；27：6-羟基吲哚（17.850 min）；28：4-氯间苯二酚（17.430 min）；29：2,7-萘二酚（20.193 min）；30：N-苯基对苯二胺（26.897 min）；31：1,5-萘二酚（19.417 min）；32：1-萘酚（27.850 min）

15种原料：1：2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐（9.180 min）；2：羟苯并吗啉（10.147 min）；3：2,6-二羟乙基氨甲苯（11.590 min）；4：3-硝基对羟乙氨基酚（13.143 min）；5：2-甲基-5-羟乙氨基苯酚（14.023 min）；6：羟乙基-3,4-亚甲二氧基苯胺盐酸盐（15.443 min）；7： 4-羟丙氨基-3-硝基苯酚（16.280 min）；8：HC黄4号（18.700 min）；9：5-氨基-6-氯邻甲酚（19.323 min）；10：HC黄2号（22.383 min）；11：5-氨基-4-氯邻甲酚（23.427 min）；12：羟乙基-2-硝基对甲苯胺（25.493 min）；13：分散紫1号（26.667 min）；14：HC橙1号（29.510 min）；15：HC红1号（30.003 min）

 

附录B

2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料信息

 

序号	中文名称	英文名称	INCI名称	CAS	分子式	分子量	含量
1	2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐	5-(2-hydroxyethylamino)-2-methoxylaniline sulfate	2-Amino-4 –hydroxyethyl aminoanisole sulfate	83763-48-8	C9H16N2O6S	280.30	≥97%
2	羟苯并吗啉	3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6-ol	Hydroxybenzomorpholine	26021-57-8	C8H9NO2	151.17	≥95%
3	2，6-二羟乙基氨甲苯	2,2ˊ-((2-Methyl-1,3-phenylene)bis(azanediyl))diethanol	2,6-Dihydroxyethylaminotoluene	149330-25-6	C11H18N2O2	210.28	≥95%
4	3-硝基对羟乙氨基酚	4-(2-Hydroxyethylamino)-3-nitrophenol	3-Nitro-p-hydroxyethylaminophenol	65235-31-6	C8H10N2O4	198.18	≥98%
5	2-甲基-5-羟乙氨基苯酚	2-Methyl-5-N-hydroxyethylamino phenol	2-Methyl-5- hydroxyethylaminophenol	55302-96-0	C9H13NO2	167.21	≥98%
6	羟乙基-3，4-亚甲二氧基苯胺盐酸盐	N-Hydroxyethyl-3,4-methylenedioxyaniline hydrochloride	Hydroxyethyl-3,4-methylenedioxyaniline HCl	94158-14-2	C9H12ClNO3	217.65	≥95%
7	4-羟丙氨基-3-硝基苯酚	4-(3-hydroxypropyl)amino-3-nitrophenol	4-Hydroxypropylamino-3-nitrophenol	92952-81-3	C9H12N2O4	212.21	≥95%
8	HC黄4号	N-[2-(2-Hydroxyethoxy)-4-nitroanilino]ethanol	HC Yellow No. 4	59820-43-8	C10H14N2O5	242.23	≥98%
9	5-氨基-6-氯邻甲酚	5- amino -6- chloro -2- methylphenol	5-Amino-6-choloro-o-cresol	84540-50-1	C7H8ClNO	157.60	≥97%
10	HC黄2号	N-(2-Nitrophenyl)-ethanolamine	HC Yellow No.2	4926-55-0	C8H10N2O3	182.18	≥99%
11	5-氨基-4-氯邻甲酚	5-amino-4-chloro-2-methylphenol	5-Amino-4-chloro-o-cresol	110102-86-8	C7H8ClNO	157.60	≥97%
12	羟乙基-2-硝基对甲苯胺	3-Nitro-4-hydroxyethylaminotoluene	Hydroxyethyl-2-nitro-p-toluidine	100418-33-5	C9H12N2O3	196.21	≥98%
13	分散紫1号	1,4-diamino-anthraquinon	Disperse Violet 1	128-95-0	C14H10N2O2	238.25	≥90%
14	HC橙1号	4-((2-nitrophenyl)amino)phenol	HC Orange NO.1	54381-08-7	C12H10N2O3	230.22	≥95%
15	HC红1号	2- nitro -4- amino diphenylamine	HC Red NO.1	2784-89-6	C12H11N3O2	229.24	≥98%

 

附录C 

2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐等15种原料阳性结果的确证

若液相色谱方法中检出结果存在不确定的情况，可采用液相色谱-质谱法进一步确证。

C.1 样品处理：见5.2。

C.2 参考色谱条件

色谱柱：C18 柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm), 或等效色谱柱；

流动相：流动相A：乙腈；流动相B：0.01 mol/L乙酸铵溶液；

梯度洗脱程序：

 

时间（min）	流动相A（%）	流动相B（%）
0	20	80
4	45	55
7	45	55
9	80	20
9.1	20	80
13	20	80

流速：0.2 mL/min；

柱温：30℃；

进样量：2 μL。

C.3 参考质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI源）；

检测模式：正、负离子多反应监测模式；离子源电压(IS)：5500V/-4500V；

碰撞气（CAD）、气帘气（CUR）、雾化气（GS1）、辅助气2（GS2）均为高纯氮气，使用前调节各气流流量以使质谱灵敏度达到检测要求。

表C.1 15种原料的监测离子对及相关电压参数设定表

 

表C.1 15种原料的监测离子对及相关电压参数设定表

序号	名称	分子量	电离模式	母离子（m/z）	子离子（m/z）	碰撞能(CE)
1	2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐	280.30	+	183.1	138.2	22
					123.1	31
2	羟苯并吗啉	151.17	+	152.1	124	25
					96.1	36
3	2，6-二羟乙基氨甲苯	210.28	+	211.2	135.1	35
					166.1	24
4	3-硝基对羟乙氨基酚	198.18	+	199.2	123.1	20
					151.1	16
5	2-甲基-5-羟乙氨基苯酚	167.21	+	168.2	150.1	20
					123.1	28
6	羟乙基-3，4-亚甲二氧基苯胺盐酸盐	217.65	+	182.1	137.1	29
					106.1	25
7	4-羟丙氨基-3-硝基苯酚	212.21	+	213.1	123.1	20
					148.2	23
8	HC黄4号	242.23	+	243.1	226.1	24
					181.1	25
9	5-氨基-6-氯邻甲酚	157.60	+	158	140.1	23
					104.1	32
10	HC黄2号	182.18	+	183.1	135.1	17
					119.1	23
11	5-氨基-4-氯邻甲酚	157.60	+	158	122.1	24
					68	32
12	羟乙基-2-硝基对甲苯胺	196.21	+	197.2	121.1	21
					149.1	18
13	分散紫1号	238.25	+	239.1	166.1	47
					139.1	61
14	HC橙1号	230.22	－	229	181	-20
					199	-20
15	HC红1号	229.24	+	230.2	195.1	20
					168.1	42

C.4定性

采用液相色谱串联质谱仪进行定性，在相同的液相色谱-质谱实验条件下，如果样品中待测原料的色谱峰保留时间与浓度相近标准溶液一致，所选择的监测离子对相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子对相对丰度比一致，相对丰度比偏差符合表C.2要求，则可以判定样品中存在该待测原料。

表C.2 阳性结果确证时相对离子丰度比的最大允许偏差

 

相对离子丰度(k)	k＞50%	50%≥k＞20%	20%≥k＞10%	k≤10%
允许的最大偏差	±20%	±25%	±30%	±50%

C.5 检出限

本确证方法中，各原料的检出限为0.03 ng。当取样量为0.5 g，定容体积为10 mL时，检出浓度为0.3 μg/g。

图C.1 混合标准溶液LC-MS色谱图

1：2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐（5.89 min）；2：2,6-二羟乙基氨甲苯（6.33 min）；3：羟苯并吗啉（6.82 min）；4：3-硝基对羟乙氨基酚（7.37 min）；5：2-甲基-5-羟乙氨基苯酚（7.57 min）；6：4-羟丙氨基-3-硝基苯酚（8.13 min）；7：羟乙基-3,4-亚甲二氧基苯胺盐酸盐（8.35 min）；8：HC黄4号（8.58 min）；9：5-氨基-6-氯邻甲酚（10.36 min）；10：HC黄2号（10.82 min）；11：5-氨基-4-氯邻甲酚（11.47 min）；12：羟乙基-2-硝基对甲苯胺（12.45 min）；13：分散紫1号（13.00 min）；14：HC橙1号（13.63 min）；15：HC红1号（13.79 min）