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化妆品防腐挑战测试 评估技术指南

「 可全国寄样/部分地区上门取样 」「 CMA/CNAS资质报告 」「 可加急检测 」

服务介绍

1.范围 本指南规定了化妆品防腐效能的评价方法。 本指南适用于化妆品防腐体系效能评价。 2.术语和定义 2.1防腐效能评价试验 将一定量的微生物人工污染到化妆品中,模拟化妆品可能出现的污染情况,每隔一定时间检测其中的存活菌量,根据存活菌量的变化评价化妆品防腐体系效能的试验方法。 2.2 中和剂 可添加至化妆品和微生物混和物中,消除化妆品中抑菌或杀菌成分对微生

服务范围全国

检测周期5-7个工作日,可加急

相关资质可提供CMA、CNAS检测报告

服务模式快递寄样、现场取样、人工送样

服务对象企事业单位、高等院校、科研院所

服务方向采购销售、竞标投标、生产研发、科研数据、诊断优化、司法服务

检测标准国家标准、行业标准、企业标准、地方标准、国外标准、非标定制

服务内容

1.范围

本指南规定了化妆品防腐效能的评价方法。

本指南适用于化妆品防腐体系效能评价。

2.术语和定义 

2.1 防腐效能评价试验

将一定量的微生物人工污染到化妆品中,模拟化妆品可能出现的污染情况,每隔一定时间检测其中的存活菌量,根据存活菌量的变化评价化妆品防腐体系效能的试验方法。

2.2 中和剂

可添加至化妆品和微生物混和物中,消除化妆品中抑菌或杀菌成分对微生物抑制或杀灭作用的试剂。

3.设备和材料

3.1 A2型生物安全柜。

3.2 高压蒸汽灭菌器。

3.3 天平:感量为0.1g。

3.4 恒温培养箱:36℃±1℃、28℃±2℃、25℃±2℃。

3.5 均质器。

3.6 无菌吸管:1mL(具0.01mL 刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或微量移液器及吸头。

3.7 显微镜。

3.8 酸度计。

3.9 涡旋混匀器。

3.10 灭菌平皿:直径90mm。

3.11 无菌玻璃棉。

4.培养基和试剂

4.1 0.85%生理盐水。

4.2 卵磷脂吐温80营养琼脂培养基,见附录A.1。

4.3 虎红(孟加拉红)培养基,见附录A.2。

4.4 含0.05%(v/v)聚山梨酯80的生理盐水,见附录A.3。

4.5 胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA),见附录A.4。

4.6 沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA),见附录A.5。

4.7 SCDLP液体培养基,见附录A.6。

4.8 Eugon LT 100 肉汤,见附录A.7。

4.9 D/E中和肉汤,见附录A.8。

4.10 改良Letheen肉汤,见附录A.9。

5.测试菌株

5.1细菌

金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003

大肠埃希氏菌CMCC(B)44102

铜绿假单胞菌CMCC(B)10104

5.2真菌

黑曲霉CMCC(F)98003

白色念珠菌CMCC(F)98001

 

在进行化妆品防腐效能评价试验时,可根据需要增加其他相关细菌或真菌作为测试菌株。

6.测试方法

6.1 供试品微生物检测

取不少于2份包装完好的供试化妆品样品,依据《化妆品安全技术规范》第五章微生物检验方法中微生物检验方法总则、菌落总数、霉菌和酵母菌检验方法对样品进行检测,检测结果应符合《化妆品安全技术规范》中的限值规定。供试品微生物检测的结果记作Nf。

6.2 微生物悬液制备

6.2.1 细菌悬液制备

用接种环从菌种保存管中(或试管斜面上)取适量菌体,分区划线接种于TSA平板,36℃±1℃培养18 h~24 h。用接种环取第1代培养物,分区划线接种于TSA平板,36℃±1℃培养18 h~24 h。挑取上述第2代培养物中典型菌落,分区划线接种于TSA平板,36℃±1℃培养18 h~24 h,即为第3代培养物。用无菌棉签取菌苔加入无菌生理盐水中,涡旋混匀。用无菌生理盐水将其稀释成约107 CFU/mL~108 CFU/mL的菌悬液。制备好的菌悬液应在2 h内使用,或在2℃~8℃保存不超过24 h。

6.2.2 白色念珠菌菌悬液的制备

用接种环从菌种保存管中(或试管斜面上)取适量菌体,分区划线接种于SDA平板,28℃±2℃培养48 h~72 h。用接种环取第1代培养物,分区划线接种于SDA平板,28℃±2℃培养48 h~72 h。挑取上述第2代培养物中典型菌落,分区划线接种于SDA平板,28℃±2℃培养48 h~72 h,即为第3代培养物。用无菌棉签取菌苔加入无菌生理盐水中,涡旋混匀。用无菌生理盐水将其稀释成约106 CFU/mL~107 CFU/mL的菌悬液。制备好的菌悬液应在2 h内使用,或在2℃~8℃保存不超过24 h。

6.2.3黑曲霉孢子悬液的制备

用接种环从菌种保存管中(或试管斜面上)取适量的菌体,分区划线接种于SDA平板上,28℃±2℃培养3 d~7 d。用无菌棉签取菌苔加入含0.05%(v/v)聚山梨酯80无菌生理盐水中,制备孢子悬液,轻轻振摇1 min 后,用无菌玻璃棉过滤除去菌丝。用含0.05%(v/v)聚山梨酯80无菌生理盐水将其稀释成约106 CFU/mL~107 CFU/mL的孢子悬液。制备好的孢子悬液应当天使用或在2℃~8℃保存不超过7 d,使用前混合均匀,并在显微镜下观察是否有孢子出芽,若有孢子出芽,则弃之不用。

表1 测试菌株培养条件

 

培养基

培养温度

培养时间

金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003

TSA

36℃±1℃

18 h~24 h

大肠埃希氏菌CMCC(B)44102

TSA

36℃±1℃

18 h~24 h

铜绿假单胞菌CMCC(B)10104

TSA

36℃±1℃

18 h~24 h

黑曲霉CMCC(F)98003

SDA

28℃±2℃

3 d~7 d

白色念珠菌CMCC(F)98001

SDA

28℃±2℃

48 h~72 h

注:实验室增加的其他测试菌株可参考以上细菌及真菌的培养温度和时间进行培养。使用的工作菌株培养物传代不可超过5次。

6.3 中和剂效果验证试验

6.3.1 工作菌悬液制备

用稀释液将上述菌悬液(或使用商业冻干菌株)10倍系列稀释至103 CFU/mL,用于中和剂效果验证。

6.3.2试验分组

每种测试菌株的中和剂效果验证试验应分别进行。

试验分为以下三组,按如下方法进行染菌。

试验组:将1 g(mL)供试品加入9 mL中和剂中,混匀,室温放置30min±15min,使其充分作用;

中和剂对照组:将1 mL稀释液加入9 mL中和剂中,混匀,室温放置30min±15min;

菌液对照组:10 mL稀释液。

在以上三组中,分别加入6.3.1中制备的工作菌悬液各1mL。

6.3.3 培养与计数

分别对试验组、中和剂对照组和菌液对照组进行平板计数,每组接种两个平皿,按照表1的要求进行培养。各组计数结果取平均值,试验组计数结果记作Nvf,中和剂对照组计数结果记作Nvn,菌液对照组计数结果记作Nv,6.1中供试品微生物检测的结果记作Nf。

6.3.4 结果判定

当Nvn / Nv 接近(如0.5 ≤ Nvn / Nv ≤ 2),并且(Nvf - Nf)/ Nvn ≥ 0.5时,判定中和剂有良好的中和效果,通过中和效果验证。

若供试品测试未能通过中和效果验证,可以更换中和剂或增加中和剂用量。可选用的中和剂请参考附录A.6~A.9,或根据需求选择适宜的中和剂进行中和效果验证。

6.4 供试品防腐挑战测试

6.4.1 供试品染菌

防腐挑战试验采用单一菌种染菌的测试方式,即分别用每种测试菌株的菌悬液人工污染供试品,每隔一定时间检测其中的存活菌量,根据存活菌量的变化判断化妆品防腐体系效能

分别取6.2中制备的菌液,加入装有不少于20 g(mL)供试品原包装中,或加入装有20 g(mL)供试品的适宜容器中,充分混匀,菌液的接种体积应不超过供试品体积的1%。细菌的染菌浓度为105 CFU/g(mL)~106 CFU/g(mL),真菌的染菌浓度为104 CFU/g(mL)~105 CFU/g(mL)。染菌后的样品放置于25℃±1℃培养箱中,分别在7、14和28天检测其中的存活菌量,分别计作Nx(X=7,14,28)(详见6.4.4中对时间点的规定)。

6.4.2 计数方法

放置至规定时间后,取1 g(mL)染菌样品,加入9 mL经6.3验证有效的中和剂中(样品的稀释倍数应参考6.3中和剂中和样品的稀释倍数,并与其保持一致,保证样品中的抑菌成分可以被有效中和),充分混匀。室温中和30min±15min后,吸取2 mL样液,分别注入到两个灭菌平皿内,每皿1 mL。将45℃~50℃的相应培养基(详见表1)15 mL~ 20 mL倾注到平皿内,充分混匀,凝固后按要求进行倒置培养、计数。如平板上预期生长菌落数较多,可进行10倍系列稀释,选择适宜的稀释度进行平板计数,或选用平板涂布法进行上述试验。

计数结果计算方法和报告方式可参考《化妆品安全技术规范》第五章2.菌落总数检验方法和6.霉菌和酵母菌检验方法。

6.4.3 计算方法

化妆品防腐效能评价用供试品中存活菌量常用对数减少值(Rx)作为评价指标,计算方式见式(1):

Rx=lgN0 - lgNx………………………………………(1)

式中:

N0——供试品初始染菌量。

Nx——不同检测时间,供试品中存活菌量。

6.4.4 结果判定

 

 

表2 化妆品防腐挑战结果判定原则

不同取样时间供试品中存活菌量常用对数减少值( )

 

细菌

白色念珠菌

黑曲霉

 

T7

T14

T28

T7

T14

T28

T14

T28

判定标准A

≥3

≥3且NI b

≥3且NI

≥1

≥1且NI

≥1且NI

≥0 c

≥1且NI

判定标准B

- d

≥3

≥3且NI

-

≥1

≥1且NI

≥0

≥0且NI

a. 在防腐效能测试中,可接受偏差范围为0.5 log;

b. NI:与上一时间点的计数结果相比,差异未超过0.5 log;

c. Nx与初始染菌量N0相比,差异未超过0.5 log时,Rx=0;

d. “–”表示无需进行测试。

—判定标准A,适用于不考虑其它控制因素条件下,产品配方能有效防止可能会对消费者构成潜在安全风险微生物增殖的产品。

—判定标准B,适用于除产品组方因素外,对微生物污染采取了经风险评估有效的其他控制方式的产品,如采用特定包装等手段控制微生物污染。

 

7.说明

化妆品注册人、备案人可以依据国家标准、技术规范、行业标准、国际标准、本技术指南或自建方法开展相关研究,并在安全评估报告中提交相关测试或者评估结论。

《化妆品防腐挑战测试评估技术指南》问答

一、《化妆品防腐挑战测试评估技术指南》为何推荐使用CMCC菌株?

《化妆品防腐挑战测试评估技术指南》(以下简称《技术指南》)推荐CMCC菌株作为测试菌株,主要基于购买流程的简便性和菌株的易得性。ATCC菌株虽然源自全球生物资源中心,但价格高昂,购买流程复杂。用户在购买ATCC菌株时,需要提供包括承诺书、申请表、单位简介、生物安全证书、产品转让协议和营业执照等多项材料,并接受中国海关的监管查验。这些要求对于国内大部分化妆品注册人、备案人来说,无疑增加了很大的难度,导致许多化妆品注册人、备案人难以从正规合法渠道获得。此外,ATCC菌株的运输周期长,可能给试验带来不确定性。相比之下,CMCC菌株作为国内的标准菌株,在价格上相对便宜且易于获得,同时其购买流程也相对简单,为化妆品注册人、备案人节省了大量时间和成本,更适合用于防腐挑战试验。

 

二、化妆品注册人、备案人可否选择其他方法进行防腐挑战试验评价?

本《技术指南》作为非强制性参考文件,其主要目的是为化妆品注册人、备案人在开展相关测试时提供指导和建议。化妆品注册人、备案人可以根据自身的实际需求和情况,选择行业标准、国际标准(如ISO 11930)或者自建方法,对产品防腐体系的有效性进行全面评价。

 

三、若产品选用附录A.6~A.9的4种中和剂,但验证结果显示这些中和剂对某些菌株仍无法有效中和,应该采取什么方法解决?

附录A.6~A.9中的4种中和剂仅为推荐使用的中和剂,化妆品注册人、备案人可根据实际产品配方自行选择适宜的中和剂。

 

四、《技术指南》中是否可以增加混合染菌接种的方式?

混合菌接种可能导致试验结果与单一菌接种存在差异,增加结果评判的复杂性和不确定性。考虑到试验结果的一致性和可重复性,以及遵循国际标准的推荐做法,《技术指南》中未采用混合染菌接种的方式。

 

五、对于防腐体系相同且配方近似的产品,防腐挑战试验的评价要求是什么?

对于防腐体系相同且配方近似的产品,可参考已有的资料和实验数据对产品防腐体系的有效性进行评估,形成防腐挑战评价报告,并提交其防腐体系和配方体系的说明材料。

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    2、提供检测的总要求,比如是检测环保要求还是性能上的检测?

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  • 化妆品皮肤不良反应是指使用化妆品引起的皮肤、黏膜、附属器病变。以下是关于化妆品皮肤不良反应的诊疗指南的主要内容:

     化妆品不良反应-病因

     

    1. 化妆品成分中的刺激和致敏物质:化妆品皮肤不良反应最常见的是接触性皮炎,常由香料、防腐剂、乳化剂、抗氧化剂、防晒剂、植物添加剂等成分引起,最常见的是香料和防腐剂。此外,表面活性剂、颜料或染料(染发剂、指甲油等)、人造指甲材料及黏合剂等也是常见的刺激物。化妆品中的光敏性成分常引发光感性皮炎。

    2. 局部皮肤屏障功能破坏:皮肤角质层细胞的致密结构与角蛋白、脂质紧密有序地排列,构成物理性屏障,以抵御外界各种物理、化学和生物性有害因素对皮肤的侵袭。皮肤屏障功能不完整或被破坏时,其对外用化学物质吸收增加,神经末梢受到的保护减少,经皮失水增加,是导致皮肤敏感的原因之一。

    3. 非法添加违禁成分或限用成分浓度超标:少数不合格化妆品中非法添加违禁成分如糖皮质激素、抗生素和重金属,或限用成分如果酸浓度超标等。可引起糖皮质激素依赖性皮炎、重金属中毒,严重者出现系统损害等。

    4. 其他:患者为自身敏感体质或患其他导致皮肤敏感的皮肤病,如玫瑰痤疮、特应性皮炎等;产品说明书不准确导致使用方法不当或未按说明书正确使用。

     化妆品不良反应-发病机制

     

    1. 刺激反应:由化妆品直接接触皮肤黏膜引起的损伤,是一种细胞毒反应。皮肤暴露于强刺激性化妆品后,受损皮肤失去完整性,表皮"砖墙结构"中双层脂质分子结构被破坏,经表皮失水增加,角质层水合程度下降,同时表皮中产生大量促炎因子。刺激性接触性皮炎无免疫记忆,参与反应的细胞包括CD4+ T细胞与Th1细胞。

    2. 变态反应:化妆品皮肤不良反应多属于此类。系化妆品成分在接触部位启动的由细胞介导的超敏反应。化妆品成分多属半抗原,进入表皮后结合载体蛋白形成完全抗原,刺激角质形成细胞释放炎症细胞因子和趋化因子,激活朗格汉斯细胞、树突细胞以及内皮细胞。当皮肤再次接触此类化妆品成分时,抗原提呈细胞激活记忆T细胞,启动炎症反应。

    3. 光敏反应:可分为光变态反应和光毒反应,以光变态反应为主,一般属于迟发型超敏反应,也有IgE介导的Ⅰ型速发型超敏反应。光能对完全抗原的形成起一定作用,可通过光化学途径改变化妆品半抗原结构,新生半抗原与蛋白结合形成新的完全抗原,诱导免疫反应发生。

    4. 致痤疮样效应:矿物油刺激毛囊皮脂腺结构,引起毛囊口上皮细胞增殖与角化过度,使皮脂排出障碍;毛囊皮脂腺导管发生机械性阻塞,致毛囊阻塞、皮脂积聚而形成痤疮。

    5. 致色素异常机制:化妆品成分可通过直接刺激、光敏反应等炎症反应刺激黑素细胞增殖和酪氨酸酶活性增高,引起皮肤色素沉着,或长期经皮吸收作用(某些染料、重金属等)导致局部皮肤色素增加。

     化妆品不良反应-临床表现及分类

     

    1. 接触性皮炎:包括非免疫性机制引起的刺激性接触性皮炎和免疫机制引起的变应性接触性皮炎。刺激性接触性皮炎为化妆品直接刺激造成的可见皮肤损害,初次使用化妆品后即可发生。变应性接触性皮炎是由于接触致敏物质引起的接触性皮炎,需一定致敏期才发生反应。

    2. 光感性皮炎:由化妆品中某些成分与光线共同作用引起的光毒性或光变应性皮炎。有明确的化妆品接触史和光照史,皮损主要发生于使用化妆品后的光照部位。

    3. 皮肤色素异常:接触化妆品的局部及邻近部位发生的慢性色素异常改变,或在化妆品接触性皮炎、光感性皮炎消退后局部遗留皮肤色素沉着、色素减退或色素脱失。

    4. 唇炎:唇部使用化妆品后发生在唇红部位的接触性皮炎,表现为干燥、裂隙、鳞屑、肿胀,可有瘙痒感。

    5. 痤疮:连续接触化妆品后,在接触部位发生的痤疮样毛囊皮脂腺炎症。发病前有明确的化妆品使用史。

    6. 接触性荨麻疹:皮损主要发生在化妆品使用部位,表现为接触化妆品后数分钟至数小时内发生水肿性红斑和风团。

    7. 毛发损害:有明确的发用化妆品使用史,如洗发护发剂、发乳、发胶、染发剂、烫发剂、生发水、纹饰材料等。使用后出现毛发变脆、分叉、断裂、脱落、失去光泽、变形等病变。

    8. 甲损害:有明确的甲用化妆品使用史,在甲及甲周发生病变。表现为甲板变形,软化剥离,脆裂,失去光泽。

    9. 其他皮肤不良反应:化妆品糖皮质激素依赖性皮炎是由于长期使用添加糖皮质激素的不合格产品,停用后出现皮肤刺痒、灼热不适及肿胀、红斑、鳞屑、丘疹、毛细血管扩张、痤疮加重等戒断症状。

    化妆品不良反应-诊断与鉴别诊断

     

    1. 诊断:各种化妆品皮肤不良反应均有化妆品使用史,停止使用可疑化妆品后症状消失或缓解,再次使用同类化妆品后症状可复发或加重,结合典型临床表现,可明确诊断。

    2. 鉴别诊断:化妆品皮肤不良反应的诊断需排除其他原因所致的皮肤病变。化妆品接触性皮炎应与湿疹、脂溢性皮炎、糖皮质激素依赖性皮炎、光线性皮炎、多形性日光疹等疾病相鉴别。

    化妆品不良反应-处理原则

     

    1. 停用引起病变或可疑引起病变的化妆品,根据不良反应的类型对症治疗。

    2. 化妆品接触性皮炎:可按接触性皮炎的治疗原则进行。以对症治疗为主,局部治疗可根据外用药使用原则进行选择。

    3. 化妆品光感性皮炎:应尽量避免阳光和紫外线暴露。按照光毒性皮炎或光变应性皮炎的治疗原则对症治疗。

    4. 化妆品皮肤色素异常:注意避免阳光和紫外线照射。可以按照一般色素沉着性皮肤病或色素脱失性皮肤病治疗。

    5. 其他:化妆品接触性荨麻疹按荨麻疹的治疗原则对症治疗;化妆品痤疮按痤疮的治疗原则,如抗炎、抗菌和角质溶解等方法对症处理。


     

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