服务介绍
传统检测单糖、双糖的分析方法有化学法、光谱法、GCMS、HPLC等方法。其中化学法无法准确测定单种糖的含量；光 谱法的工作繁琐、误差比较大；GC-MS方法需要进行衍生化反 应，前处理复杂，不利于快速分析；HPLC法虽然相比其他方法灵 敏度好、检测速度快、适用范围广，但也存在检出限较低、抗干 扰能力差，尤其对于食品中低浓度的单糖、双糖很难进行精确的 测定，无法满足
服务范围全国
检测周期5-7个工作日，可加急
相关资质可提供CMA、CNAS检测报告
服务模式快递寄样、现场取样、人工送样
服务对象企事业单位、高等院校、科研院所
服务方向采购销售、竞标投标、生产研发、科研数据、诊断优化、司法服务
检测标准国家标准、行业标准、企业标准、地方标准、国外标准、非标定制
服务内容
传统检测单糖、双糖的分析方法有化学法、光谱法、GCMS、HPLC等方法。其中化学法无法准确测定单种糖的含量；光谱法的工作繁琐、误差比较大；GC-MS方法需要进行衍生化反应，前处理复杂，不利于快速分析；HPLC法虽然相比其他方法灵 敏度好、检测速度快、适用范围广，但也存在检出限较低、抗干 扰能力差，尤其对于食品中低浓度的单糖、双糖很难进行精确的 测定，无法满足现阶段对食品检测快速、灵敏、准确的要求。LCMS/MS技术通过质谱的高选择性和高灵敏度能够降低目标物的检 出限、提高检测的重现性。 由于糖类为水溶性化合物，在常规的C18色谱柱上没有保留， 而采用其他填料的亲水色谱柱也很难得到太好的峰形或分离度。 因此，选取一款合适的分析糖的色谱柱是液质分析糖的实验关键点。目前专门测试糖的糖柱通常为液相柱，需要用到100%纯水相来作为流动相，并且流速通常高于1 mL/min，这样的色谱条件 对于大多数的质谱离子源来说都无法实现化合物的有效离子化， 或者只有通过分流才能实现，但是分流后将损失仪器的检测灵敏 度，失去了使用液质联用仪测试糖的提高灵敏度的目的。 SCIEX 的 LC-MS/MS液质联用系统的一大特点就是强大的 TurboV™离子源技术，离子源的加热能够达到750℃，ESI源耐受流速 范围 5 µL/min～3.0 mL/min，APCI源耐受流速范围50 µL/ min～3.0 mL/ min，因此可以直接使用HPLC糖柱在SCIEX液质联用仪上进行测试， 即实现了好的分离效果，又提高了检测灵敏度。本实验使用SCIEX Triple Quad™ 4500 质谱系统同时测定梨中的葡萄糖、果糖、蔗糖 和山梨醇四种糖, 实验方法简单、灵敏度高、选择性好。
实验思路
1. 配制果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇标准曲线，测试四种水溶性 糖的最低检出限；
2. 测试砀山酥梨果实中四种水溶性糖的含量，了解梨中四种糖的 比例关系。
样品处理
1．移取果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇标准品，用纯水稀释，配制 成 50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 µg/mL、5 µg/mL 和 10 µg/mL 的标准溶液。
2．梨果实中可溶性糖的提取。
梨果实中糖的提取
材料：砀山酥梨
将样品去皮削成小块，液氮速冻后储存于-80冰箱。称取2g样 品，加液氮研磨后，加入80%乙醇7 mL混匀。在37℃水浴中恒温 30 min，超声提取15 min，10000 r/min离心15 min。将上清液移 入25 mL容量瓶。重复提取3次，最后加入80%乙醇定容至25 mL。 取2 mL溶液旋转蒸发，用1 mL水溶解蒸干后的固体，溶解时用超 声波处理，尽量溶解完全。溶液离心后，用0.22 µm水系滤膜处 理，即可用于测定。
实验过程中发现此前处理过程提取出的糖样品在液质仪器上 的响应信号过高，最终样品又用纯水稀释10倍和1000倍分别上机 测试。
色谱方法
色谱柱：Hi-Plex Ca, 300×7.7 mm；
流动相：100%纯水洗脱
流速：1 mL/min； 柱温：85℃；
进样量：10 µL
质谱方法
SCIEX Triple Quad™ 4500 质谱系统
扫描方式：MRM采集方式
离子源：APCI Negative
离子源参数
CUR：气帘气 25.00 psi
NC：离子化电流 -2.00 uA
TEM：加热温度 400.00 ℃
GS1：喷雾气 75psi
CAD：碰撞气 Medium
果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇的结果与讨论
1、果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇的色谱条件的选择
本实验选择使用液相糖分析柱Hi-Plex Ca, 300×7.7 mm， 1 mL/min 纯水流动相，对果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇四种 糖进行分离，其中果糖和葡萄糖为同分异构体，用该色谱柱 可以得到很好的分离，每种化合物的峰形都很对称，峰形较峰形较好。图 1 为 1ppm（μg/mL）果糖、葡萄糖、蔗糖 和山梨醇标准品的
实验中也测试了液质色谱柱Phenomenex Luna NH2，3 µm， 150×2 mm，该色谱柱也能得到较好的峰形，但整体灵敏度比HiPlex Ca糖柱低一半，图2为1 ppm（ng/mL）果糖、葡萄糖、蔗糖 和山梨醇标准品用Luna NH2柱测试的XIC提取离子流色谱图。如若 没有专门的糖柱也可以使用此款氨基柱做可溶性糖的分析。
2、果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇质谱条件的选择
糖类化合物分子中只含有C、H、O原子，极性中等，适合用APCI源分析，而结构中含有-0H羟基，较容易失去H形成[M-H]脱氢离子，但糖类的热稳定性不好，高温下易分解和碳化，因此最终优化后的质谱条件加热温度为400℃。
3、果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇的样品提取条件的优化
本实验中样品提取过程基于以前使用液相检测时的灵敏度而开发，因此在用80%乙醇水对样品提取之后，通过旋转蒸发再用纯水复溶的过程将80%乙醇水溶剂替换成纯水。
而采用液质联用技术方法检测灵敏度比液相提高1000倍以上，样品浓度无需过高，因此在原有的提取步骤之后，只需用纯水将样品稀释10倍以上，过滤膜即可上机测试。既可以降低样品的基质效应，又大大缩短了样品前处理所需时间。
4、果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇的线性范围
用纯水逐级稀释果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇标准工作溶液至50ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 μg/mL、5 ug/mL 和10 μg/mL，分别进样，以峰面积对浓度做标准曲线。图3、图4、图5、图6为四种糖的线性范围及线性相关系数R。
5、果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇的定量限
计算50 ng/mL 果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇的信噪比。图7为每个化合物的信号和噪音的峰峰比计算值。
从信噪比计算值推测，果糖和葡萄糖的定量限为50 ng/mL;蔗糖定量限低于50 ng/mL，约为30 ng/mL;山梨醇定量限约为10 ng/mL.
6、果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇的样品结果
实验中的砀山酥梨采集于南京农业大学江浦园艺实验站，经过特殊的栽培处理条件，采集处理后1h、5h、9h、13h、17h和21h(小时)6个时间点的样品，分别以S-1、5-2、S-3、S-4、S-5和S-6表示，每个样品平行处理2次，纯水稀释1000倍上机测试，取两次测试结果的平均值，得到样品中果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇的含量结果，如表2。
从测试结果发现随着栽培处理时间的增长，梨样品中4种糖的含量也在逐渐增大，S-5样品即栽培处理经17小时梨样品中四种糖含量达到了最大值，到21小时梨中的含糖量开始下降。比较砀山酥梨S-5样品中四种糖的含量，发现山梨醇的含量最高，是果糖含量的2.5倍，是葡萄糖和蔗糖的约5倍。山梨醇甜度与葡萄糖相当，但能给人以浓厚感，在梨、桃、苹果中广泛分布，在人体内不转化为葡萄糖，不受胰岛素的控制，适合糖尿病人使用。
以S-5样品为例，按照前处理的称样量推算，假设一个砀山酥梨质量为500 g，去皮去核净重约400 g，那么吃一个梨摄入的糖量为果糖129、葡萄糖79、蔗糖79、山梨醇329。但如果以S-1样品为例，吃一个梨所摄入的糖量每种都不足S-5样品的十分之一。可见不同的栽培处理条件对于水果中糖分的积累影响非常之大。本实验样品与市售水果差异较大，实验结果仅供科研，不能作为日常饮食参考。
本实验通过SCIEX LC-MS/MS技术同时检测了果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇四种可溶性糖，实验中测试了不同的色谱柱对灵敏度的影响，最终选择了HPLC糖柱来分析。利用了SCIEX Turbo VTM离子源强大的耐高流速的特点，在SCIEXTriple Quadm 4500系统上直接使用了HPLC色谱条件，100%纯水1mUmin流速下做液质分析，依然得到了良好的检测灵敏度。方法的定量限s50ng/mL。
以砀山酥梨为样品进行了可溶性糖的提取前处理，用该液质方法进行糖含量检测，检测结果显示经过不同时间的栽培处理梨中糖分含量差异很大，以含糖量最高时的梨样品为例，推算出此时1个梨果实中约含果糖12g、葡萄糖79、蔗糖79、山梨醇32g。
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