蛋白质芯片是一种高通量的蛋白质免疫检测分析技术，可简单地理解为多重 ELISA。但不同于传统 ELISA 的是，它一次试验最多可以同步检测成百上千种目标因子，非常适用于效应指标筛选，且最低仅需10~100 μL样品。

蛋白芯片扫描技术原理

蛋白质芯片目前采用的检测方法主要有双抗夹心法和样品标记法两种：双抗夹心法与 ELISA 的原理类似。首先将捕获抗体预固定在固相载体上并制成芯片。生物样品加到芯片上一起孵育后，加入生物素标记的检测抗体进行孵育，最后通过 HRP- 链霉亲和素或荧光剂 - 链霉亲和素用于信号检测。该方法特异性、重复性、稳定性和灵敏度都非常好。样本标记法只需要一个捕获抗体。该方法在检测前，先将生物样品进行生物素标记，然后将标记好的样品加到含有捕获抗体的芯片上进行孵育。最后加入 HRP- 链霉亲和素或荧光剂 - 链霉亲和素用于信号检测。该方法适用于检测没有合适的抗体对来建立双抗夹心法检测的分析物，并且避免了抗体间的相互干扰，一个芯片上可以检测几百甚至上千个蛋白。

蛋白芯片扫描技术优势

蛋白芯片扫描应用方向

蛋白芯片扫描送样标准

• 1.1 定性蛋白质组

  实验类型	送样建议
  胶点胶条	送考马斯亮蓝染色或银染后的胶点/胶条，要求条带清晰，无降解，面积1cm2。 注：考马斯亮蓝染色的条带鉴定到目标蛋白的概率高于银染。 4℃保存，放入EP管中，加入去离子水浸泡，冰袋寄送。
  互相作用谱（IP／Co－IP／Pull－down）	方案一：IP／Co-IP／Pull-down 的蛋白洗脱液，跑SDS-PAGE胶后，进行染色（建议考染。）.将整个泳道按照轻重链切成五份，轻链重链合并为一个样本，剩下的三个样本作为独立样本，此方案鉴定到目标蛋白的概率最高。 注：此方案相当于 4个独立的样本。费用相当于 4份。 方案二：IP／Co-IP／Pull-down的蛋白洗脱液，跑SDS-PAGE胶，不跑完整个泳道，在样本跑出分离胶1cm后停止电泳，进行染色（建议考染），切胶送样。此方案鉴定到目标蛋白的概率降低，因为shot-gun优先检测高丰度蛋白。 方案三：送蛋白溶液，必须提供溶液成分或详细样本处理过程及试剂，蛋白总量为50 μg以上。此方案需要沟通评估。

• 1.2 外泌体蛋白质组（Label-free）

  样本来源	Label-free		外泌体鉴定
  	超速离心		透射电镜	粒径及浓度	流式检测（1个指标）		WB检测（1个指标）
  血清/血浆	5mL		0.3mL	0.3mL	0.5mL		0.5mL
  细胞上清	100mL		1mL	1mL	2mL		5mL
  尿液	100mL		5mL	5mL	10mL		25mL
  唾液	15mL		2ml	2ml	4mL		8mL
  脑脊液	15mL		1.5ml	1.5ml	3mL		6mL
  羊水	15mL		2ml	2ml	4mL		8mL
  精液	10mL		0.3mL	0.3mL	0.5mL		0.5mL
  胆汁	15mL		0.3mL	0.3mL	0.5mL		0.5mL
  腹水	30mL		2mL	2mL	5mL		15mL
  乳液	50mL		2ml	2ml	4mL		8mL
  卵泡液	15mL		2ml	2ml	4mL		8mL
  外泌体	100 μg /1×108个		15μL	15μL	10μL		20μL
  动物组织	3g		0.3g	0.3g	0.5g		1g
  外泌体	1g		0.5g	0.5g	/		/

  ﹡超速离心法分离的外泌体根据样本量可执行Label-free或DIA技术。
  ﹡分离外泌体前的样本不能加入任何 RNA保护剂（如 Trizol）。
   

• 1.3 定量蛋白质组

  样本类型			label free	iTRAQ/TMT	DIA	PRM
  动物 组织	常规组织（脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉等		20 mg	30 mg	30 mg	40 mg
  	坚硬组织（软骨、毛发）		400 mg	500 mg	500 mg	500 mg
  植物 组织	柔软组织（木本植物的叶、花等，草本植物，藻类，蕨类植物）		200 mg	300 mg	300 mg	300 mg
  	坚硬组织（树根、树皮、树枝，果实种子等）		2 g	3 g	3 g	3 g
  	花粉		100 μL	200 μL	200 μL	200 μL
  微生物	常见细菌、真菌菌体		50 mg或 50 μL沉淀	100mg或 100 μL沉淀	100 mg或 100 μL沉淀	100 mg或 100 μL沉淀
  宏蛋白质组	粪便、淤泥、发酵物等		3 g	/	4 g	/
  细胞	悬浮/贴壁培养细胞（因为细胞大小不一，重点是必须达到要求的体积）		3×106(20μL细胞沉淀）	6×106(40μL细胞沉淀）	6×106(40μL细胞沉淀）	9×106(60μL细胞沉淀）
  液体类	血浆/血清		10μL（不去高丰度）	20μL（不去高丰度）	100μl（大于10个样本）	20μL（不去高丰度）
  			200μL（去除高丰度）	400μL（去除高丰度）		400μL（去除高丰度）
  	脑脊液		请提供≥250μL，建议500μL
  	尿液		15 mL	30 mL	30 mL	30 mL
  	唾液/泪液		400μL	600μL	600μL	600μL
  	乳汁		2mL	2mL	2mL	2mL
  	培养基上清（此类样本通常蛋白浓度较低，建议浓缩后送样）		10mL	10mL	10mL	10mL
  蛋白类（需提供溶剂热缓冲液试剂成分）	不含去垢剂类蛋白（最佳 buffer 是 6M Urea，建议浓度≥0.5μg/μL）		50μg	100μg	100μg	100μg
  	含去垢剂类蛋白(含 SDS，triton X-100，NP40， CHAPS 等去垢剂，建议浓度≥0.5μg/μL)		150μg	300μg	300μg	300μg
  FFPE	每片厚度10μm，组织面积1cm2（约10ug/片）		10片	20片	10片	10片

  ﹡以上各样本类型送样量均为 2 次送样量，建议客户送样时均按照上述送样量送样以保证项目顺利执行；若需按照 1 次送样量送样，需后台评估并向客户说明系列风险。
  ﹡样本类型为蛋白溶液或者蛋白干粉时，需提供 SDS-PAGE电泳图及定量结果，用于确认蛋白提取效果；若其缓冲液中含有去垢剂或者蛋白溶液的浓度低于0.5 ug/uL则需要对蛋白进行纯化/浓缩，纯化/浓缩过程中会损失部分蛋白，因此送样量需要大幅提高。
   

• 1.4 修饰蛋白质组

  样本类型		磷酸化 （label free/DIA）	标记磷酸化 （TMT）	酰化/泛素化/甲基化	标记乙酰化（TMT）	N-/O-糖基化*	组蛋白修饰
  动物组织	常规组织（脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉等）	300mg	100mg	1.5g	200mg	100mg	100mg
  	坚硬组织（软骨、毛发）	3g	500mg	10g	700mg	1g	1g
  植物组织	柔软组织（木本植物的叶、花等，草本植物，藻类，蕨类植物）	2.5g	500mg	10g	700mg	800mg	1g
  	坚硬组织（树根、树皮、树枝，果实种子等）	10g	3g	20g	5g	4g	5g
  	花粉	800μL	200μL	2mL	300μL	300μL	400μL
  微生物	常见细菌、真菌菌体	200mg或200μL沉淀	100mg或100μL沉淀	1g或1mL沉淀	100mg或100μL沉淀	/	150mg或150μL沉淀
  细胞	悬浮/贴壁培养细胞（因为细胞大小不一，重点是必须达到要求的体积）	2×107或100μL细胞沉淀	5×106或30 μL细胞沉淀	1×108或500μL细胞沉淀	7×106或40μL细胞沉淀	1×107或50μL细胞沉淀	1×107或50μL细胞沉淀
  液体类	血浆/血清（不去高丰度）	1mL	500μL	1.5mL	700μL	500μL	——
  	唾液/泪液	2mL	600μL	3mL	900μL	1mL	——
  其它	不含去垢剂类蛋白（最佳buffer 是 6M Urea，建议浓度≥0.5μg/μL）		2mg	400μg	10mg	600μg	800μg	60μg（纯组蛋白）
  	含去垢剂类蛋白(含SDS，triton X-100，NP40，CHAPS 等去垢剂，建议浓度≥0.5μg/μl)		4mg	800μg	20mg	1.2mg	1.6mg	——

  ﹡上述样本需求量均为 1 次送样量。
  ﹡酰化修饰包括乙酰化、琥珀酰化、丙酰化、丙二酰化、戊二酰化；甲基化包括精氨酸单甲基化、赖氨酸泛甲基化。
  ﹡组蛋白饰理论上适用于所有真核生物及其相应组织细胞等，其修饰包含磷酸化、甲基化（单甲基化、二甲基化、三甲基化等）、酰化（乙酰化、丙二酰化、丁酰化、戊二酰化、琥珀酰化、巴豆酰化）等；组蛋白修饰只接收未经处理的样品或纯组蛋白，不接收半加工的样品，尤其是加入裂解液或提取出总蛋白的样品。
  ﹡样本类型为蛋白溶液或者蛋白干粉时，需提供 SDS-PAGE 电泳图及定量结果，用于确认蛋白提取效果；若其缓冲液中含有去垢剂或者蛋白溶液的浓度低于 0.5ug/ul，则需要对蛋白进行纯化/浓缩，纯化/浓缩过程中会损失部分蛋白，因此送样量需要大幅提高。
  ﹡糖基化修饰物种类型只可以接人、大小鼠、植物，若有其他物种需求，请联系对应产品经理。

 蛋白芯片扫描样本预处理及保存

• 2.1 动物组织样本

  （1）常规动物组织(脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉等)
      1）根据研究目的取特定部位组织，如果组织上有血液残留，用预冷的生理盐水/PBS将其清洗干净；
      2）将组织剪切成长0.5 cm小块或100 mg左右的小块装入EP管中；
      3）注明组织具体部位，做好标记，液氮速冻5min以上，-80℃保存，避免反复冻融。
  （2）软体动物 (血吸虫、旋毛虫等)
      1）收集样本，用预冷的PBS去除污染物；
      2）做好标记，液氮速冻5min以上，-80℃保存，避免反复冻融。
  （3）动物坚韧组织（软骨、毛发等）
      1）根据研究目的取特定部位组织，去除非目标组织，并用预冷的PBS洗去附着物；
      2）注明组织具体部位，做好标记，液氮速冻5min以上，-80℃保存，避免反复冻融。

• 2.2 植物组织样本

  （1）植物的叶、花、果实、种子、树根、树皮等及蕨类等
      1）根据研究目的取特定部位组织，去除非目标组织，取样后用预冷的PBS清洗2-3遍，去除杂质；
      2）注明组织具体部位，做好标记后液氮速冻5min以上，-80℃保存，避免反复冻融。
  （2）花粉
  开花期收集花粉，在显微镜下检查花粉并去除杂质，转入EP管内，液氮速冻，-80℃保存。
  （3）藻类组织
  根据不同的藻类采取合适的离心力，分离藻类同时保证细胞完整，PBS洗涤2-3次，液氮速冻，-80℃保存。

• 2.3 微生物样本

      1）采用离心法收集菌体，用预冷的PBS快速冲洗2-3次，避免培养基蛋白对菌的污染；
      2）每次清洗后4℃，5000 g离心5min将上清完全弃去，菌体收集在1.5mL进口离心管（冻存管）中，记录菌体积，液氮速冻后，-80℃冰箱保存。

• 2.4 细胞样本

  （1）悬浮细胞
      1）400-1000 g，离心5-10 min收集悬浮细胞，弃上清；
      2）用预冷的PBS溶液洗2-3遍，离心弃上清，收集细胞于1.5ml离心管中；
      3）建议每个样品至少2-3管，每管细胞体积大于50μl，记录细胞体积，液氮速冻后，-80℃冰箱保存。
  （2）贴壁细胞
      1）培养好的细胞去除培养基，用预冷的PBS溶液清洗细胞表面2-3遍；
      2）将含细胞的培养皿置于冰上，加入0.5ml 裂解液（6M 尿素，0.1M 碳酸氢铵，0.2%SDS），轻轻摇晃培养皿，用细胞刮将细胞刮下，吸取细胞和裂解液到1.5mL离心管；
      3）建议每个样品至少2-3管，每管细胞体积大于50μl。记录细胞体积，液氮速冻后，-80℃冰箱保存。
  注：
      1）裂解液使用前加入蛋白酶抑制剂（如有条件；Roche，货号：5892791001）；如果进行磷酸化检测，裂解液中需加入磷酸酶抑制剂（Roche，货号：4906845001）。
      2）若无此裂解液，也可按照贴壁细胞传代流程，采用胰酶酶解使贴壁细胞脱落，用预冷的PBS溶液清洗细胞2-3遍，再送样。

• 2.5 液体样本

  （1）血浆
      1）使用EDTA抗凝管（紫色头盖）采集血液样本，轻轻地上下颠倒混匀8-10次，立即4℃, 1600 g离心10min；
      2）用移液器将上层血浆转移至进口1.5ml离心管中，立即添加蛋白酶抑制剂混匀(如有条件)，液氮速冻，-80℃冰箱保存。
  （2）血清
      1）收集全血至不含抗凝剂的离心管或真空采血管（红色头盖）中，4℃静置15-30min进行凝固分层，4℃，1600 g离心10min（为保证血清质量可再离心一次）；2）用移液器将血清转移至进口1.5ml离心管中，立即添加蛋白酶抑制剂混匀(如有条件) ，液氮速冻，-80℃冰箱保存。
  注：
      1）样品制备过程中不能溶血，可能出现溶血的原因有：穿刺时消毒的碘或酒精没有完全干透；采血过程对静脉血管过多冲击；摇匀力度太大；抗凝标本摇匀不足；标本保存运送过程温度太高或太低；取血的胳膊同时也在输液；用留置针输液，拔出后马上取血；患者服用消炎药物（如阿司匹林）等。
  对于溶血建议解决方法：专业采血人员进行采血；轻柔摇动混匀；上下摇动十次以上；尽量避开治疗和服用特殊药物时采血
  血样比色卡    2）如果血浆样本需要去除高丰度蛋白或制备外泌体，在收集样本时不能使用肝素抗凝剂，只能使用EDTA等其他抗凝剂。
      3）血清参考得率：30%~50%（例如：1mL全血大约能得0.3~0.5mL血清）；
  血浆参考得率：约50%（例如：1mL 全血大约能得 0.5mL 血浆）。
      4）对于做Blood Plus 需NP富集的，建议血液样本在3个月以内，越新鲜越好。
  （3）唾液
      1）取样前禁食2h以上，上午9 -12点取样最佳，将唾液外吐于无菌痰杯内（保持冰浴），不要咳痰，短时间内收集足量样本；
      2） 1000g-2000 g离心5min , 取上清于1.5ml离心管(或使用0.22μm滤膜过滤)，液氮速冻，-80℃保存。
  （4）泪液
  使用毛细管微量移液管收集样品于进口离心管，4℃，8000-14000 g，离心5min , 取上清于1.5ml离心管内，液氮速冻，-80℃保存。
  （5）尿液
      1）采集受试者晨起或晨间1h的中/后段“新鲜”尿液，于4℃临时保存（不得超过8 h），注意避免细菌污染，收集前注意对饮食的控制；
      2）4℃，3000 g离心15min，去除细胞或细胞碎片，液氮速冻15min，-80℃冰箱保存，足量干冰寄送。
  （6）乳汁
  收集乳汁于离心管中，液氮速冻，-80℃冻存。
  （7）脑脊液/关节液/淋巴液/腹水/胸水等
      1）收集体液并立即置于冰上，避免血液污染。
      2）4℃，2000 g，离心10-15min，去除细胞或者细胞碎片等。
      3）取上清分装到离心管中，液氮速冻，-80℃冻存。
  （8）羊水
      1）羊膜穿刺法取羊水。
      2）4℃，10000g离心15min，去除细胞及细胞碎片。
      3）将上清立即转移至新的1.5ml离心管中，液氮速冻，-80℃冻存。。
  （9）细菌培养上清液
      1）细菌培养一段时间后，根据实验设计或细菌培养状态选择合适时间收集细菌上清。
      2）4℃，10000 g，离心10-15 min去除细菌，取上清分装到离心管中，液氮速冻，-80℃冻存。
  （10）细胞培养上清液
      1）培养细胞去除旧培养基，用PBS清洗2-3遍，然后加入无血清培养基继续培养一段时间。
      2）根据实验设计或细胞培养状态选择合适时间收集细胞上清。
      3）4℃，1000 g，离心10 min去除细胞，收集上清。
      4）4℃，10000 g，离心10min去掉细胞碎片，取上清分装到离心管中，液氮速冻，-80℃冻存。
  注:
      1）收集细胞上清液前，细胞培养基必须使用无血清培养基，避免血清干扰；
      2） 细胞需无衣原体、支原体及其他微生物污染，否则可能会影响后续数据质量。

• 2.6 其它

  （1）蛋白溶液
  请提供蛋白提取方法及溶解缓冲液信息，裂解液可以用 6M 尿素含0.1-1%SDS；其他溶解缓冲液可以使用纯水或PBS，如使用其他buffer请提前咨询是否兼容, 并填写到送样单上。
  （2）组蛋白沉淀或溶液
  收集组蛋白沉淀或将组蛋白溶于 40 μL pH 为 8.0 的 50mM 的NH4HCO3溶液中，-80℃冻存；请提供组蛋白提取方法，且如果使用其他溶解buffer时，请提前咨询是否兼容, 并填写到送样单上。
  （3）外泌体
      1）外泌体得率：处于不同发育阶段以及不同生长条件的样本中所含有的外泌体的量不同，在某些实验条件下或某些病变部位获得的样本中外泌体的量可能与常规相应样本有显著的差异；
      2）储存条件以及储存时间影响外泌体得率，一般从新鲜的样本中能够得到预期的外泌体产。即使保存在-80℃冰箱中的样本，如果储存时间过长，外泌体产量也会显著降低。 
      3）样本采集后，样本迅速放入进口高质量冻存管中，拧紧后立即到-80℃中保存。细胞上清样本处理后储存于-80℃冰箱中。在-20℃冰箱中储存不宜超过1个月。
      4）提取好的外泌体保存：对于一些功能性实验，建议直接使用新鲜提取或保存 在 4℃悬浮于 PBS 中，注意保存液中不能含有去污剂成分。4℃保存不超过一周，对于长期保存用于治疗应用的外泌体，-80℃存储条件将更可取。
  （4）蛇、蝎毒液等（干重）
  一般分为2种方法，可根据自身实验条件进行选择：
      （1）真空干燥（减压干燥）：低压下使蝎毒液中的水分快速蒸发，蝎毒干燥后，应缓缓旋开活塞，以防止空气冲散。取出干粉，立即分装，密封低温保存。
      （2）真空冷冻干燥：先将蝎毒液在低温冰柜中预冻成固体，然后使用冷冻干燥机进行干燥和低温保存。由于冷冻干燥是在低温和高真空下进行的，所以毒液在冻干过程中不起泡、不沾壁、疏松、易取出、易溶于水、有利于保存。
      （3）干蛇毒必须避光包装保存，放置阴凉地方或冰箱内冷藏。
  （5）发酵液
  4℃，10000rpm-20000rpm离心30-60min（或使用 0.22μm 滤膜过滤），取上清；液氮速冻5min，保存于-80℃。

注意事项

• 1、胶点胶条样品，4℃保存，放入EP管中，加入去离子水浸泡，冰袋寄送。
• 2、动植物组织、菌体、细胞沉淀、体液样本、培养基上清和蛋白溶液，样品收集后立即置于液氮中冷冻5min，磷酸化蛋白质组推荐加入磷酸酶抑制剂 （Roche，货号：5892791001），-80℃保存，干冰寄送。
• 3、若送样为提取好的蛋白，需提供SDS-PAGE电泳图，检测蛋白提取效果，同时满足蛋白浓度在1ug/ul以上。
• 4、需要制备外泌体的体液样本，建议1个月内启动项目，长期保存可能影响外泌体形态。
• 5、若送样为蛋白溶液，需提供提取过程使用的试剂成分。样品如有特殊处理，请注明处理的过程及使用的试剂配方。
• 6、样品中有毒性或腐蚀性的物质，必须事先声明；病原性微生物或具有侵染性的病变组织，需灭活后送样。
• 7、若样品材料具有特殊性请备注说明，如具有很厚的荚膜、容易氧化等。
• 8、若客户需要特殊的处理方法，请备注说明。
• 9、建议选用进口离心管、冻存管或干净的锡箔纸保存样本，离心管使用Parafilm 封口膜密封管口。
• 10、样品标记需清晰明确。建议进行双重标记，使用高质量的油性笔在每个样品盛放管上清晰、简明地标记样品名称，样品管请用封口膜封口，将样品名称等各种信息写在标签纸上，贴在管壁，外面再用透明胶带缠绕一圈，与样品信息单中保持一致。
• 11、样品信息单中务必准确填写样品物种拉丁名、组织来源、蛋白数据库、样品标记名称、管数、样本差异分析组合信息等。

您也可以致电400-9621-929与我们联系或填写下方表格，让专家工程师和您讨论具体的需求。